Реакции синтеза органических веществ идут в клетке одновременно с процессами расщепления. Сложные специфические биополимеры (белки, жиры, углеводы, нуклеиновые кислоты) синтезируются из простых веществ, образовавшихся в результате процессов диссимиляции.
Синтезируемые органические вещества используются для построения различных органоидов клетки, ферментов, секретов и запасных веществ, взамен израсходованных. Все эти процессы идут с поглощением энергии. Синтез веществ, идущий в клетке, называют биосинтезом или пластическим обменом.
На этом этапе на ряде промежуточных звеньев суммарно выделяется 2600 кДж энергии.
На образование 36 макроэргических связей при превращении АДФ в АТФ затрачивается 1440 кДж, или 54% освобождаемой энергии, которая переходит в потенциальную энергию АТФ. Следовательно, при кислородном расщеплении образуется в 13 раз больше энергии, чем при бескислородном, а клеткой в форме АТФ ее сберегается в 18 раз больше.
Суммарное уравнение полного расщепления глюкозы на двух этапах можно записать так:
По способу получения органических соединений все клетки делятся на автотрофные и гетеротрофные (см. раздел «Ботаника»).
Образовавшаяся при этом АТФ по каналам эндоплазматической сети направляется в другие участки клетки, где возникает в ней потребность. Таким образом, из образовавшейся энергии при расщеплении глюкозы для клетки суммарно сохраняется 80 кДж + 1440 кДж = 1520 кДж, или 55% энергии, которая переходит в потенциальную энергию и в дальнейшем используется клеткой. Поэтому реакция расщепления называется энергетическим обменом.
Фотосинтез (цв. табл. I) - это уникальный процесс образования органических соединений из неорганических веществ с использованием энергии света. Впервые процесс фотосинтеза и роль в нем хлорофилла растений описал выдающийся русский ученый Климент Аркадьевич Тимирязев (1843-1920). Фотосинтез - это сложный многоступенчатый процесс, протекающий в две фазы - световую и темновую.
Световая фаза начинается с освещения хлоропласта видимым светом. Под действием квантов света некоторые из подвижных электронов молекул хлорофилла переходят на более высокий энергетический уровень и приобретают потенциальную энергию. Часть таких «возбужденных» электронов возвращается на прежнее место, а выделяющаяся при этом энергия рассеивается в виде тепла. Другая их часть при участии переносчиков выступает в роли восстановителей и присоединяется к ионам водорода, постоянно образующимся в клетках при диссоциации молекул воды (Н 2 O =Н + +ОН —). Ионы водорода, присоединив электрон, превращаются в атомы водорода (Н + +е — = Н) и соединяются с молекулами веществ-переносчиков.
Ионы ОН — , оставшиеся без противоионов водорода, отдают свои электроны другим ионам и превращаются в радикалы ОН (ОН =е — +ОН). Взаимодействуя между собой, они образуют воду и молекулярный кислород (40Н= 2Н 2 O+O 2).
Процесс образования молекулярного кислорода при разложении воды под влиянием энергии света называется фотолизом воды. Его впервые изучил и описал советский ученый Александр Павлович Виноградов (1895 -1975), используя метод меченых атомов. По своему механизму фотолиз воды сходен с электролизом воды.
Кроме того, в световую фазу некоторые из «возбужденных» электронов хлорофилла и электронов, отделившихся от ионов ОН — , участвуют в образовании макроэргической фосфатной связи при синтезе АТФ из АДФ и неорганического фосфата (ф) (АДФ + Ф = АТФ).
Таким образом, в световую фазу фотосинтеза в результате поглощения хлорофиллом световой энергии за счет «возбужденных» электронов происходит фотолиз воды с выделением кислорода и синтез АТФ.
Темновая фаза фотосинтеза состоит из ряда последовательных ферментативных реакций по связыванию СO 2 , в результате которых образуется глюкоза, служащая исходным материалом для биосинтеза других органических веществ растения. Этот процесс идет за счет энергии АТФ при участии атомов водорода, образовавшихся в световую фазу (6СO 2 +24Н=С 6 Н 12 O 6 +6Н 2 O).
Суммарное уравнение фотосинтеза следующее:
6СO 2 +6Н 2 O = С 6 Н 12 O 6 + 6O 2
Мембранная структура хлоропласта осуществляет при этом разграничение реакционноспособных веществ.
Продуктивность фотосинтеза - 1 г органического вещества на 1 м 2 листьев в 1 ч. Ежегодно в результате фотосинтеза образуется около 400 млрд. т органического вещества. Годовая потребность одного человека в кислороде обеспечивается функционированием 10-12 деревьев среднего возраста в течение вегетации. Установлено, что продуктивность фотосинтеза возрастает с повышением, до определенного уровня, интенсивности освещения, содержания СO 2 , температуры и влажности окружающего воздуха. Эти закономерности широко используют при выращивании растений в защищенном грунте.
Хемосинтез был открыт в 1888 г. русским биологом С. Н. Виноградским, доказавшим способность некоторых бактерий ассимилировать углекислоту за счет химической энергии. Существует несколько групп хемосинтезирующих бактерий, из которых наибольшее значение имеют нитрофицирующие, серобактерии и железобактерии. Например, нитрофицирующие бактерии получают энергию для синтеза органических веществ, окисляя аммиак до азотистой, а затем до азотной кислоты; серобактерии - окисляя сероводород до сульфатов, а железобактерии - превращая закисные соли железа в окисные. Освобожденная энергия аккумулируется в клетках хемосинтезирующих бактерий в форме АТФ. Процесс хемосинтеза, при котором из СO 2 образуется органическое вещество, протекает аналогично темновой фазе фотосинтеза.
Благодаря жизнедеятельности бактерий - хемосинтетиков в природе накапливаются большие залежи селитры и болотной руды.
Биосинтез белков идет в каждой живой клетке. Наиболее активен он в молодых растущих клетках, где синтезируются белки, идущие на построение их органоидов, а также в секреторных клетках, где синтезируются белки-ферменты и белки-гормоны.
Основная роль в определении структуры белков принадлежит ДНК. Отрезок ДНК, состоящий из нескольких сот нуклеотидов, содержащий информацию о структуре одного белка, называют геном. Одна макромолекула ДНК содержит несколько сот генов. В молекуле записан код о последовательности аминокислот в белке в виде Определенно сочетающихся нуклеотидов. Сущность кода ДНК состоит в том, что каждой аминокислоте соответствует участок цепи ДНК из трех рядом стоящих нуклеотидов - триплетов . Например, А - - Ц - А соответствует аминокислоте цистеину, А - А - Ц - лейцину, Т - Т - Т - лизину и т. д. Разных аминокислот 20, число возможных сочетаний из 4 нуклеотидов по 3 равно 64. Следовательно, триплетов с избытком хватит для всех аминокислот.
Биосинтез белка - сложный многоступенчатый процесс, представляющий цепь синтетических реакций, протекающих по принципу матричного синтеза.
Суть реакций матричного синтеза состоит в том, что новые молекулы белка синтезируются в точном соответствии с планом, заложенным в структуре существующих молекул ДНК. В этих реакциях обеспечивается точная специфическая последовательность мономеров в синтезируемых полимерах.
В биосинтезе белка определяют следующие этапы, идущие в различных частях клетки.
Синтез и-РНК (происходит в ядре). Информация, содержащаяся в гене ДНК, переписывается на и-РНК. Этот процесс называется транскрипцией (от лат. «транскриптис» - переписывание).
При этом против каждого нуклеотида одной из цепей ДНК встает комплементарный ему нуклеотид и-РНК. Молекулы и-РНК индивидуальны, каждая из них несет информацию одного гена.
Соединение аминокислот с молекулами т-РНК (происходит в цитоплазме). Молекулы т-РНК состоят из 70-80 нуклеотидов. В цепочке т-РНК имеется ряд нуклеотидных звеньев, комплементарных друг другу. При сближении они слипаются, образуя структуру, напоминающую лист клевера (61). К «черешку» листа присоединяется определенная аминокислота, а на «верхушке» листа расположен кодовый триплет нуклеотидов, соответствующий определенной аминокислоте. Для каждой из 20 аминокислот существует своя т-РНК.
«Сборка белка» (происходит в рибосомах). К рибосомам направляются из ядра и-РНК. При этом на одной молекуле и-РНК одновременно располагаются несколько рибосом, образующих комплекс, называемый полирибосомой. Это обеспечивает одновременный синтез большого количества одинаковых молекул белка.
Из цитоплазмы т-РНК с «навешенными» на них аминокислотами подходят к рибосомам и своим кодовым концом дотрагиваются до триплета нуклеотидов и-РНК, проходящего в данный момент через рибосому. В это время противоположный конец т-РНК с аминокислотой попадает в место «сборки» белка и, если кодовый триплет т-РНК окажется комплементарным триплету и-РНК, находящемуся в данный момент в рибосоме, аминокислота отделяется от т-РНК и попадает в состав белка, а рибосома делает «шаг» на один триплет по и-РНК (триплеты и-РНК, соответствующие каждой из 20 аминокислот, см. в приложении).
Отдав аминокислоту, т-РНК покидает рибосому, ей на смену приходит другая, с иной аминокислотой, составляющей следующее звено в строящейся белковой молекуле (62). Так звено за звеном собирается полипептидная цепь белка, а информация о структуре белка, записанная в и-РНК в виде последовательности нуклеотидов, воспроизводится на полипептидной цепи белка в виде последовательности аминокислот. Этот процесс называется трансляцией (от лат. «трансляция» - перенос) (см. приложение, задачу 2 и таблицу). Когда синтез молекулы белка закончен, рибосома сходит с и-РНК. Образовавшийся белок поступает в эндоплазматическую сеть и по ее каналам в другие части клетки, а рибосома поступает на другую и-РНК и участвует в синтезе другого белка. Все реакции белкового синтеза катализируются специальными ферментами, а энергию доставляет АТФ.
Антибиотики – специальные продукты жизнедеятельности микроорганизмов и их модификации, которые обладают высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам микроорганизмов (вирусам, бактериям, грибам, водорослям) или к злокачественным опухолям. Традиционные представления об антибиотиках связаны с их широким применением в современной медицине и ветеринарии. Некоторые антибиотические препараты применяют как стимуляторы роста животных, в борьбе с болезнями растений, при консервировании пищевых продуктов и в научных исследованиях (в области биохимии, молекулярной биологии, генетике, онкологии). В соответствии с классификацией, в основе которой лежит химическое строение, антибиотики можно разделить наследующие группы:
1. Ациклические соединения (исключая жирные кислоты и терпены)
2. Алициклические соединения (в том числе тетрациклины)
3. Ароматические соединения
5. Кислородсодержащие гетероциклы
7. Пептиды
В настоящее время различают три способа получения антибиотиков: биологический, метод получения полусиитетических препаратов и синтез химических соединений - аналогов природных антибиотиков.
Синтетические антибиотики
Изучение химической структуры антибиотиков дало возможность получать их методом химического синтеза. Одним из первых антибиотиков, полученных таким методом, был левомицетин. Большие успехи в развитии, химии привели к созданию антибиотиков с направленно измененными свойствами, обладающих пролонгированным действием, активных в отношении устойчивых к пенициллину стафилококков. К пролонгированным препаратам относятся экмоновоциллин, бициллин 1,3,5.
Полусинтетические антибиотики
Их готовят комбинированным способом: методом биологического синтеза получают основное ядро молекулы нативного антибиотика, а методом химического синтеза, путем частичного изменения химической структуры - полусинтетические препараты. Большим достижением является разработка метода получения полусинтетических пенициллинов. Методом биологического синтеза было извлечено ядро молекулы пенициллина - 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК), которая обладала слабой антимикробной активностью. Путем присоединения к молекуле 6-АПК бензильной группы создан бензилпенициллин, который теперь получают и методом биологического синтеза.
Широко применяемый в медицине под названием пенициллин, бензилпеиициллин обладает сильной химиотерапевтической активностью, но активен лишь в отношении грамположительиых микробов и не действует на устойчивые микроорганизмы, особенно стафилококки, образующие фермент - β-лактамазу. Бензилпенициллин быстро теряет свою активность в кислой и щелочной средах, поэтому его нельзя применять внутрь, так как он разрушается в желудочно-кишечном тракте. Полусинтетические препараты получают также на основе 7-аминоцефалоспориновой кислоты (7-АЦК). Производные 7-АЦК: цефалотин, цефалоридин (цепории) не дают аллергических реакций у лиц, чувствительных к пенициллину. Получены и другие полусинтетические антибиотики, например рифампицип - эффективный противотуберкулезный препарат.
Биологический синтез
Полностью химическая структура установлена одной трети известных антибиотиков и только половина из них может быть получена химическим синтезом. Поэтому микробиологический синтез получения антибиотических средств очень актуален. Синтез микроорганизмами антибиотиков – одна из форм проявления антагонизма; связан с определенным характером обмена веществ, возникшим и закрепленным ходе его эволюции, то есть это наследственная особенность, выражающаяся в образовании одного и более определенных, строго специфичных для каждого вида антибиотических веществ.
Промышленное получение антибиотиков, как правило, осуществляется путем биосинтеза и включает следующие стадии:
· выбор высокопроизводительных штаммов продуцента (до 45 тыс. ЕД/мл)
· выбор питательной среды;
· процесс биосинтеза;
· выделение антибиотика из культуральной жидкости;
· очистка антибиотика.
Выбор высокопроизводительных штаммов продуцента. Природные штаммы в большинстве своем малоактивны и не могут использоваться для промышленных целей. Поэтому после отбора наиболее активного природного штамма для повышения его продуктивности применяют различные мутагены, вызывающие стойкие наследственные изменения. Эффективными мутагенами являются мутагены физической природы - ультрафиолетовое и рентгеновское излучение, быстрые нейтроны или химические вещества. Использование мутагенов позволяет не только повысить продуктивность природного штамма, но и получать штаммы с новыми неизвестными для природного микроорганизма свойствами.
Большое значение для биосинтеза антибиотика имеет подбор рационального состава питательных сред. Понятие «среда для культивирования» включает не только определенный качественный и количественный состав компонентов или отдельных элементов, необходимых для конструктивного и энергетического омена организма (источники азота, углерода, фосфора, источники ряда микроэлементов, витамины и ростовые вещества), но также и физико-химические и физические факторы (активная кислотность, окислительно-восстановительный потенциал, температура, аэрация и др.). Все эти факторы взаимосвязаны и играют существенную роль при развитии микроорганизмов.
Подбирая среды нужного состава, следует учитывать специфику культивируемого организма. Это необходимо для создания оптимальных условий, которые бы способствовали наилучшему росту микроба и биосинтезу необходимых продуктов жизнедеятельности. Например, если организм не может синтезировать некоторые существенные для него жизнедеятельности соединения (как например, аминокислоты или витамины) из простых веществ субстрата, то для его развития следует в состав ввести готовые аминокислоты или витамины. К таким «требовательным» организмам относятся некоторые виды бактерий (молочнокислые и др.). Актиномицеты и преимущественно плесневые грибы, как правило, строят вещества своего тела и довольно сложные по составу конечные продукты обмена из соединений, образуемых из простых компонентов субстрата.
Методы культивирования продуцентов антибиотиков
В современных условиях наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов - продуцентов антибиотиков или других биологически активных соединений признан метод глубинного культивирования. Метод состоит в том, что микроорганизм развивается в толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно пропускается стерильный воздух, и среда перемешивается.
Можно указать четыре основные модификации глубинного способа выращивания микроорганизмов.
1. Периодическое культивирование. При этом способе весь процесс развития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментере, после чего ферментер освобождается от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежей питательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом, и процесс возобновляется.2. Отъемный метод. Культивирование микроорганизмов осуществляется в ферментерах с периодическим отбором части объема культуральной жидкости (от 30 до 60% общего объема). Объем культуральной жидкости в ферментере при этом доводится свежей питательной средой до исходного уровня.
3. Батарейный способ. Развитие микроорганизмов проходит в ряду последовательно соединенных ферментеров. Культуральная жидкость на определенной стадии развития микроорганизма перекачивается из первого ферментера во второй, затем из второго - в третий и т. д. Освобожденный ферментер немедленно заполняется свежей питательной средой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания микроорганизмов происходит более рациональное использование емкостей.
4. Непрерывное культивирование. Метод принципиально отличен от указанных модификаций глубинного культивирования продуцентов антибиотиков. В основе этого метода лежит то, что развитие микроорганизма происходит в условиях непрерывного протока питательной среды, что позволяет поддерживать развитие микроорганизма на определенной стадии его роста. Стадия развития микроорганизма определяется исходя из наиболее выгодного для максимального биосинтеза антибиотика или другого биологически активного соединения.
Еще один метод культивирования микроорганизмов – поверхностное культивирование. Метод поверхностного культивирования на различных агаризованных средах широко применяется в лабораторной практике и в некоторых промышленных процессах, в частности для сохранения коллекционных культур, для изучения физиологических и биохимических свойств микроорганизмов, для аналитических целей. В промышленном масштабе этот метод нашел применение при получении спорового материала для производства органических кислот с помощью плесневых грибов рода Aspergillus.
При поверхностном методе культуру микроорганизма-продуцента выращивают на поверхности тонкого слоя жидкой или твердой среда. Жидкие питательные среда используют в основном при производстве органических кислот (лимонной, итаконовой), твердые - при производстве комплексов на основе крахмального и целлюлозу содержащего сырья.
Методы выделения антибиотиков из культуральной жидкости весьма разнообразны и определяются химической природой антибиотика. В основном используют следующие методы:
1. Высев почвенной взвеси в воде на поверхность агаровой пластинки. Определенная навеска почвы, тщательно растертая в ступке с небольшим объемом воды, количественно переносится в колбу со стерильной водой. Содержимое колбы встряхивается в течение 5 мни, а затем из водной суспензии делается ряд последовательных разведений, которые высеваются на соответствующую авизированную среду. Для получения в дальнейшем чистых культур отдельные колонии после инкубация в термостате при нужной температуре пересеваются в пробирки со скошенным питательным агаром. Каждая чистая культура микроорганизма пересевается на различные по составу среды и после достаточно хорошего развития проверяются ее антибиотические свойства.
2. Высев почвы на питательный агар, предварительно засеянный тест-организмом . Поверхность питательного агара засевается тест - культурой необходимого организма, после чего на агаровую пластинку раскладывают небольшие, не более просяного зерна, комочки почвы или же почву наносят в виде пыли, распределяя ее по всей поверхности пластинки. Затем чашки помещают в термостат и через определенный промежуток времени (24-48 ч, а иногда и более) просматривают кусочки почвы или отдельные ее участки, вокруг которых образовались зоны задержки роста тест-организма. Из этих участков выделяют чистые культуры организмов и подвергают их дальнейшему изучению.
3. Метод обогащения почвы. Почву, из которой предполагают выделить антагонистов, обогащают организмами тех видов, по отношению к которым хотят получить антагонист. С этой целью к образцам почвы, помешенным в стеклянные сосуды, систематически добавляют отмытую суспензию нужных микроорганизмов. Затем через определенные промежутки времени такая почва высевается в виде отдельных комочков на агаровые пластинки в чашках Петри, предварительно засеянные тем же самым организмом, который использовался для обогащения почвы.
4. Метод центрифугирования почвенной суспензии. Для выделения актиномицетов из почв и особенно из почв в весеннее время, когда в ней развивается большое число грибов и бактерий, применяетсяметод центрифугирования почвенной взвеси. Метод основан на различии скорости оседания отдельных видов микроорганизмов в центробежном поле. При 3000 об/мин в течение 20 мин частицы, соответствующие по размерам спорам плесеней или клеткам бактерий осаждаются на дно пробирки. Частицы же, соответствующие по размерам спорам актиномицетов, оказываются при данной скорости центрифугирования в поверхностном слое жидкости. Высевая надосадочную жидкость, удается в большинстве случаев (до 92%) получить на пластинках питательного агара только колонии актиномицетов.
5. Метод замораживания - оттаивания почвы. Известно, что микроорганизмы в почве находятся в адсорбированном на почвенных частицах состоянии. Для полноты десорбции микроорганизмов с почвенных частиц применяются различные методы: химические, при которых почвенные образцы обрабатывают различными детергентами, физические, в основе которых лежит метод механического растирания образцов почвы.
Для лучшей десорбции микроорганизмов с почвенных частиц рекомендуется использовать метод замораживания - оттаиванияпочвы. Суть метода состоит в следующем. Отобранный для выделения актиномицетов образец почвы помещается в испаритель бытового холодильника при температуре 8°. Через час образец извлекается из холодильника и выдерживается при комнатной температуре до полного оттаивания. Процедуру замораживания-оттаивания повторяют дважды. Затем навеску почвы помещают в стерильную водопроводную воду, взбалтывают суспензию в течение 15 мин на круговой качалке при 230 об/мин, после чего различные разведения суспензии высевают на питательную агаровую пластинку в чашках Петри.
Метод замораживания - оттаивания образцов почвы позволяет обнаружить в них в 1,2-3,6 раза больше актиномицетов, чем в тех же образцах без замораживания. Это, по-видимому, связано с повышением десорбции актиномицетов с поверхности почвенных частиц. Очистка антибиотика производится хроматографическими методами (хроматография на оксиде алюминия, целлюлозе, ионитах) или противоточной экстракцией. Очищенные антибиотики подвергают лиофильной сушке. После выделения антибиотика проводят испытания его чистоты. Для этого определяют его элементный состав, физико-химические константы (температуру плавления, молекулярную массу, адсорбцию в видимой, УФ- и ИК-областях спектра, удельное вращение). Исследуют также антибактериальную активность, стерильность и токсичность антибиотика.
Токсичность антибиотиков определяют на экспериментальных животных, которым в течение определенного периода внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно или иным путем вводят различные дозы изучаемого антибиотика. При отсутствии внешних изменений в поведении животных в течение 12-15 сут считают, что испытуемый антибиотик не обладает заметными токсическими свойствами. При более глубоком исследовании выясняют, обладает ли данный антибиотик скрытой токсичностью и влияет ли на отдельные ткани и органы животных. Одновременно исследуют характер биологического действия антибиотика - бактериостатический или бактерицидный, что позволяет прогнозировать механизмы его антибактериальных свойств.
Следующий этап изучения антибиотика - оценка его терапевтических свойств. Экспериментальных животных заражают определенным видом патогенного микроба. Минимальное количество антибиотика, предохраняющее животного от смертельной дозы инфекции, является минимальной терапевтической дозой. Чем больше отношение токсичной дозы антибиотика к терапевтической, тем выше терапевтический индекс. Если терапевтическая доза равна токсической или приближается к ней (низкий терапевтический индекс), то вероятность применения антибиотика в лечебной практике ограничена или совсем невозможна. В том случае, когда антибиотик входит в широкую медицинскую практику, разрабатывают промышленные методы его получения и детально изучают его химическую структуру.
Стандартизация антибиотиков
За единицу антибиотической активности принимают минимальное количество антибиотика, способное подавить развитие или задержать рост стандартного штамма тест-микроба в определенном объеме питательной среды. Величину биологической активности антибиотиков выражают обычно в условных единицах дозы (ЕД), содержащихся в 1 мл раствора (ЕД/мл) или в 1 мг препарата (ЕД/мг). Например, за единицу антибиотической активности пенициллина принято считать минимальное количество препарата, способное задерживать рост золотистого стафилоккока стандартного штамма 209 в 50 мл питательного бульона. Для стрептомицина за единицу активности принято считать минимальное количество антибиотика, задерживающее рост Е. coli в 1 мл питательного бульона.
После того как многие антибиотики были получены в чистом виде, для некоторых из них стали выражать биологическую активность в массовых единицах. Например, установлено, что 1 мг чистого основания стрептомицина эквивалентен 1000 ЕД. Следовательно, 1 ЕД активности стрептомицина эквивалентна 1 мкг чистого основания этого антибиотика. Поэтому в настоящее время в большинстве случаев количество стрептомицина выражают в мкг/мг или мкг/мл. Чем ближе число мкг/мг в препаратах стрептомицина к 1000, тем, следовательно, чище препарат. Понятно, что единица биологической активности антибиотика не всегда совпадает с 1 мкг. Например, для бензилпенициллина 1 ЕД эквивалентна примерно 0,6 мкг, так как 1 мг антибиотика содержит 1667 ЕД.
Методы анализа антибиотиков
В отличие от некоторых других природных соединений (алкалоиды, гликозиды) для антибиотиков не существует общих групповых реакций. Такие реакции могут быть использованы только для антибиотиков одного химического класса, например для тетрациклинов или нит-рофенилалкиламинов (левомицетинов). Для идентификации антибиотиков могут быть использованы различные цветные реакции на соответствующие функциональные группы; спектральные характеристики в видимой, УФ- и ИК-областях спектра; хроматографические методы. Для количественного определения антибиотиков используют биологические, химические, физико-химические методы.
Биологические методы основаны на непосредственном биологическом действии антибиотика на применяемый тест-организм, чувствительный к данному антибиотику. Применяемый при этом диффузионный метод основан на способности молекул антибиотиков диффундировать в агаровых средах. Оценивается размер зоны, в которой используемые тест-организмы не развиваются. Этот размер зависит от химической природы антибиотика, его концентрации, рН и состава среды, температуры эксперимента.
В основе другой разновидности биологического тестирования лежит турби-диметрия - метод количественного анализа по интенсивности света, поглощенного взвешенными частицами - клетками микроорганизмов. При добавлении определенных количеств антибиотиков наблюдается задержка роста клеток микроорганизмов (бактериостатический эффект), а затем их гибель (бактерицидный эффект). При этом изменяется (уменьшается) интенсивность поглощенного света. В качестве альтернативного турбидиметрии метода может быть использован нефелометрический метод количественного анализа по интенсивности света, рассеянного микроорганизмами.
Для количественного определения антибиотиков применяют различные спектральные методы - в первую очередь, фотоколориметрический и спект-рофотометрические методы. Например, для определения концентрации раствора эритромицина можно применить фотоколориметрический метод, основанный на изменении абсорбции раствора антибиотика после взаимодействия его с серной кислотой. Антибиотики тетрациклинового ряда могут быть определены спектрофотометрическим методом по полосе поглощения, исчезающей после щелочного гидролиза действующего вещества. Разработан способ, сочетающий физико-химический и биологический подходы к оценке активности ЛС. Метод основан на лазерной дифракции в среде, содержащей клетки микроорганизмов при действии на них химических веществ, в частности антибиотиков
Сохранение штаммов продуцентов антибиотиков в активном состоянии
Важное значение для промышленного получения антибиотиков, а также для лабораторных исследований продуцентов антибиотических веществ имеют методы поддержания жизнеспособности организмов, позволяющие сохранить их антибиотическую активность на постоянном уровне. Известно, что микроорганизмы и в особенности актиномицеты легко изменяются при обычных методах их хранения. Причём довольно часто при этом наблюдается полная или частичная потеря антибиотических свойств. Потеря антибиотических свойств зависит, по-видимому, от того, что мы не умеем в обычных условиях культивирования создать такие условия, которые бы способствовали сохранению организмом его основных физиологических особенностей. Нередко потеря активности наблюдается при культивировании микроорганизмов на богатых по составу средах и при частых пересевах.
Вместе с тем изменение физиологических или биохимических свойств продуцентов антибиотических веществ может определяться, их генетическими закономерностями. Известно, например, что продуцент грамицидина С в процессе развития диссоциирует на ряд вариантов, некоторые из которых не образуют этот антибиотик. Причем процесс диссоциации культуры идет в направлении образования в большом количестве биологически неактивных вариантов, что в конечном итоге приводит к полной потере культурой способности образования грамицидина. В настоящее время используется ряд методов сохранения культур продуцентов антибиотиков, обеспечивающий их длительное пребывание в активном состоянии. В основу этих методов положен принцип задержки развития микроорганизмов, принцип консервации. Для каждого вида продуцента антибиотических веществ должен быть подобран свой, наиболее подходящий метод консервирования, позволяющий сохранить культуры в активном состоянии в течение относительно длительного времени.
Наиболее распространенными методами сохранения культур микроорганизмов-продуцентов антибиотиков в активном состоянии являются следующие.
1. Лиофилизация культур.
2. Хранение вегетативных клеток или спор организмов в стерильной почве, стерильном песке или на семенах некоторых растений (например, просе). По данным ряда авторов, культуры актиномицетов, находящихся в стерильной почве, сохраняют жизнеспособность в течение 30 лет и более.
3. Хранение спор в виде водных суспензий в запаянных ампулах.
4. Хранение спор в стерильном кварцевом песке.
5. Хранение культур на агаровом косячке под минеральным маслом.
6. Хранение культур при низких температурах (+4, +5°С).
7. В последнее время для сохранения различных микроорганизмов в активном состоянии используют жидкий азот, в который помешают отмытую от среды суспензию клеток. Иногда в газообразной фазе жидкого азота сохраняют культуры актиномицетов, находящиеся на агаровых блочках, вырезанных из агаровой пластинки в чашках Петри.
Наилучшей формой сохранения организмов, при которой не наблюдается потери антибиотической активности, является их лиофилизация - метод пригоден как для спорообразующнх, так в для бесспоровых культур микроорганизмов. Сущность этого метода состоит в том, что суспензия клеток или спор микроорганизма, приготовленная на среде, богатой белками (часто используется для этих целей кровяная сыворотка), быстро замораживается при температуре от - 40 до - 60°С и высушивается под вакуумом до остаточной влажности (0,5-0,7%). После такой обработки ампулы со спорами или клетками лиофнлизированного микроба запаивают. Лиофилизированные формы бактерий могут сохраняться в течение 16-18 лет, споры грибов не теряют основных свойств при хранении их в лиофилизированном виде в течение 10 лет.
ДНК – носитель всей генетической информации в клетке – непосредственного участия в синтезе белка (реализации этой наследственной информации) не принимают. В клетках животных и растений молекулы ДНК отделены ядерной мембраной от цитоплазмы, где происходит синтез белков. К рибосомам - местам сборки белков - высылается из ядра посредник, который несет скопированную информацию и способен пройти через поры ядерной мембраны. Таким посредником является информационная РНК, которая участвует в матричных реакциях.
Матричные реакции - это реакции синтеза новых соединений на основе «старых» макромолекул, выполняющих роль матрицы, т. е. формы, образца для копирования новых молекул. Матричными реакциями реализации наследственной информации, в которых принимают участие ДНК и РНК являются:
1. Репликация ДНК – удвоение молекул ДНК, благодаря которым передача генетической информации осуществляется от поколения к поколению. Матрицей является материнская ДНК.
2. Транскрипция (лат. transcription – переписывание) – это синтез молекул РНК по принципу комплементарности на матрице одной из цепей ДНК. Происходит в ядре под действием фермента ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Информационная РНК – это одноцепочная молекула, и копирование гена идет с одной нити двуцепочной молекулы ДНК. Язык триплетов ДНК переводится на язык кодонов и-РНК. В результате транскрипции разных генов синтезируются все виды РНК. Затем и-РНК, т-РНК, р-РНК через поры в ядерной оболочке выходят в цитоплазму клетки для выполнения своих функций.
3. Трансляция (лат. translatio – передача, перевод) – это синтез полипетдиных цепей белков на матрице зрелой и-РНК, осуществляемый рибосомами. В этом процессе выделяют несколько этапов:
Этап первый – инициация (начало синтеза). В цитоплазме на один из концов и-РНК (именно на тот, с которого начинался синтез молекулы в ядре) вступает рибосома и начинает синтез полипептида. Молекула т-РНК, транспортирующая аминокислоту глутамин (т-РНК ГЛН), соединяется с рибосомой и прикрепляется к началу цепи и-РНК (кодом УАГ). Рядом с первой т-РНК (не имеющей никакого отношения к синтезирующему белку) присоединяется вторая т-РНК с аминокислотой. Если антикодон т-РНК, то между аминокислотами возникает пептидная связь, которую образует определенный фермент. После этого т-РНК покидает рибосому (уходит в цитоплазму за новой аминокислотой), а и-РНК перемещается на один кодон.
Второй этап – элонгация (удлинения цепи). Рибосома перемещается по молекуле и-РНК не плавно, а прерывисто, триплет за триплетом. Третья т-РНК с аминокислотой связывается своим антикодоном с кодоном и-РНК. При установлении комплиментарности связи рибосома делает еще шаг на один «кодон», а специфический фермент «сшивает» пептидной связью вторую и третью аминокислоту - образуется пептидная цепь. Аминокислоты в растущей полипептидной цепи соединяются в той последовательности, в которой расположены шифрующие их кодоны и-РНК (рис. 14).
Третий этап – терминация (окончание синтеза) цепи. Происходит при трансляции рибосомой одного из трех «нонсенс-кодонов» (УАА, УАГ, УГА). Рибосомы соскакивают с и-РНК, синтез белка завершен.
Таким образом, зная порядок расположения аминокислот в молекуле белка, можно определить порядок нуклеотидов (триплетов) в цепи и-РНК, а по ней – порядок пар нуклеотидов в участке ДНК и наоборот, учитывая принцип комплиментарности нуклеотидов.
Но в процессе матричных реакций могут происходить изменения – мутации. Это генные мутации на молекулярном уровне - результат различных повреждений в молекулах ДНК – затрагивают один или несколько нуклеотидов. Все формы генных мутаций можно разделить на две большие группы.
Первая группа - сдвиг рамки считывания – представляет собой вставки или выпадения одной или нескольких дар нуклеотидов. В зависимости от места нарушения изменяется то или иное количество кодонов. Это наиболее тяжелые повреждения генов, так как в белок будут включены совершенно другие аминокислоты. На такие делеции и вставки приходится 80% всех спонтанных генных мутаций.
Наибольшим повреждающим действием обладают нонсенс – мутации, которые связаны с появлением кодонов-терминаторов, вызывающих остановку синтеза белка. Это может привести к преждевременному окончанию синтеза белка, который быстро деградирует. Результат – гибель клетки или изменение характера индивидуального развития.
Мутации, связанные с заменой, выпадением или вставкой в кодирующей части гена фенотипически проявляются в виде замены аминокислот в белке. В зависимости от природы аминокислот и функциональной значимости нарушенного участка, наблюдается полная или частичная потеря функциональной активности белка. Это выражается в снижении жизнеспособности, изменении признаков организмов и т.д.
Вторая группа – это генные мутации с заменой пар оснований нуклеотидов. Существуют два типа замены оснований:
1. Транзиция – замена одного пуринового на другое пуриновое основание (А на Г или Г на А) или одного пиримидинового на другое пиримидиновое (Ц на Т или Т на Ц).
2. Трансверсия– замена одного пуринового основания на пиримидиновое или наоборот (А на Ц, или Г на Т, или А на У). Примером трансверсии является серповидно-клеточная анемия, возникающая из-за наследственного нарушения структуры гемоглобина. У мутантного гена, кодирующего одну из цепей гемоглобина, нарушен всего один нуклеотид, и в и-РНК происходит замена аденина на урацил (ГААна ГУА). В результате происходит изменение биохимического фенотипа, в β-цепи гемоглобина глутаминовая кислота заменена на валин. Эта замена изменяет поверхность гемоглобиновой молекулы: вместо двояковогнутого диска клетки эритроцитов становятся похожи на серпы и либо закупоривают мелкие сосуды, либо быстро удаляются из кровообращения, что быстро приводит к анемии.
Таким образом, значимость генных мутаций для жизнедеятельности организма неодинакова:
· некоторые «молчащие мутации» не оказывают влияния на структуру и функцию белка (например, замена нуклеотида, не приводящая к замене аминокислот);
· некоторые мутации ведут к полной потере функции белка и гибели клеток (например, нонсенс-мутации);
· другие мутации - при качественном изменении и-РНК и аминокислот ведут к изменению признаков организма;
· некоторые мутации, изменяющие свойства белковых молекул, оказывают повреждающее действие на жизнедеятельность клеток – такие мутации обусловливают тяжелое течение болезней (например, трансверсии).
Биологический синтез белка является очень сложным многоступенчатым процессом. В настоящее время доказано, что биосинтез белка происходит не в ядре, а в цитоплазме. Непосредственного участия в синтезе белка ДНК не принимает. Роль посредника, функцией которого является перевод наследственной информации о химическом составе и структуре белков, хранящийся в ДНК, в полипептидную цепь определенного белка выполняют рибонуклеиновые кислоты (и-РНК, т-РНК). Большое значение в биосинтезе белка имеет информационная РНК. Она выполняет роль матрицы. Количество образующихся на ДНК молекул и-РНК определяется числом генов, контролирующих у определенного организма синтез специфических белков. Каждый белок требует для синтеза свой и-РНК, одна молекула которой «списывает» последовательность нуклеотидов с участка ДНК, равному одному гену, а затем, и-РНК переносит эту информацию на последовательность расположения аминокислот в полипептидной цепи белка. Информационная РНК из ядра проникает в цитоплазму и действует на рибосомах по отношению к белкам, как матрица.
Биосинтез белка начинается с процесса под названием транскрипция (от английского transcription - переписывание, копия). На участке определенного гена молекулы ДНК синтезируется м-РНК. Синтез м-РНК осуществляется с помощью многих ферментов, но главная роль принадлежит РНК-полимеразе, которая прикрепляется к начальной точке молекулы ДНК инициации транскрипции под названием промотор, расплетает двойную спираль и синтезирует м-РНК. Промотор расположен перед геном и у эукариотов включает около 80, а у вирусов и бактерий около 10 нуклеотидов.
РНК-полимераза движется вдоль гена и ведет синтез и-РНК. Синтезированная молекула м-РНК отделяется от ДНК, а участки гена на которых образовалась эта кислота, вновь соединяются. Окончание синтеза м-РНК определяет участок, который получил название - терминатор. Нуклеотиды промотора и терминатора узнают специфические белки, которые регулируют активность РНК-полимеразы.
В настоящее время доказано, что сначала синтезируется предшественни м-РНК так называемая про-м-РНК. Эта кислота имеет большие размеры, чем м-РНК и содержит фрагменты не кодирующие синтез пептидной цепи определенного белка. Связано это с тем, что в ДНК наряду с участками кодирующими р-РНК, т-РНК и полипептиды имеются фрагменты не несущие генетической информации. Эти фрагменты получили название интронов, а кодирующие фрагменты названы экзонами. После образования про-и-РНК, происходит процесс созревания м-РНК, который получил название процессинга. В процессе созревания м-РНК интроны удаляются специальными ферментами, а информативные участки (экзоны) соединяются между собой в строгом порядке с помощью ферментов лигаз. Этот процесс называется сплайсингом (от английского splice - сращивать). Биологическое значение и роль интронов остаются не ясными. Однако, установлено, что при считывании в ДНК только экзонов, зрелая м-РНК не образуется.
Следующим этапом биосинтеза является трансляция, которая происходит в цитоплазме на рибосомах. Суть ее в том, что последовательность расположения нуклеопептидов в м-РНК переводится в строго упорядоченную последовательность расположения аминокислот в молекуле синтезируемого белка. Этот процесс протекает при активном участии т-РНК и состоит из активирования аминокислот и непосредственного синтеза белковой молекулы. Свободные аминокислоты активируются и присоединяются к т-РНК при помощи фермента аминоацил-т-РНК-синтеталы. Активированные аминокислоты т-РНК доставляются на рибосомы. Эти органоиды цитоплазмы состоят из двух субчастиц, одна из которых имеет константу седиментации 30 S, вторая 50 S. Молекула м-РНК выходит из ядра в цитоплазму и прикрепляется к малой субчастице рибосомы. Сигналом к трансляции служит стартовый кодон АУГ. Когда т-РНК доставляет к рибосоме активированную аминокислоту, ее антикодон соединяется с комплементарным кодоном м-РНК. Акцепторный конец т-РНК с соответствующей аминокислотой присоединяется к поверхности большой субъединицы рибосомы. Затем следующая т-РНК доставляет следующую аминокислоту и т. д. Молекула м-РНК работает на нескольких рибосомах, соединенных в полисомы. Начало синтеза полипептидной цепи называется элонгацией. Окончание синтеза полипептидной цепи называется терминацией. Терминация наступает когда на м-РНК появляется один из кодонов-терминаторов УАА, УАТ или УГА.
Смотрите также
Биогеохимия: история и современность
Введение
Биогеохимия - наука, изучающая жизнедеятельность организмов в качестве
ведущего фактора миграции и распределения масс химических элементов на Земле.
Предметом изучения биогео...
Что такое жизнь с точки зрения физики
ВВЕДЕНИЕ
К
современному естествознанию относятся теоретические концепции, сформировавшиеся
на протяжении ХХ века в рамках различных научных дисциплин. Важнейшей,
естественной наукой...
Влияние биоритмов на организм человека
Введение
биоритм медицинский работоспособность спортсмен
О
существовании биологических ритмов людям известно с древних времен. Уже в
«Ветхом Завете» даны указания о правильном образе ж...
Обмен веществ и превращение энергии - основа жизнедеятельности клетки. Энергетический обмен в клетке и его сущность. Значение АТФ в энергетическом обмене.
Пластический обмен. Фотосинтез. Пути повышения продуктивности сельскохозяйственных растений. Биосинтез белков. Ген и его роль в биосинтезе. Код ДНК. Реакция матричного синтеза. Взаимосвязь процессов пластического и энергетического обмена.
Вопросы для самопроверки:
В чем заключается биологический синтез? Приведите примеры.
Дайте определение ассимиляции.
Что такое генетический код? Сформулируйте основное свойства генетического кода?
Где синтезируются рибонуклеиновые кислоты?
Где происходит синтез белка? Расскажите, как осуществляется синтез 6eлкa.
Что такое диссимиляция? Охарактеризуйте этапы диссимиляции.
В чем заключается роль АТФ в обмене веществ в клетке?
Расскажите об энергетическом обмене в клетке на примере расщепления глюкозы.
Какие типы питания организмов вам известны? Какие организмы называются автотрофными? На какие группы делятся автотрофные организмы?
Охарактеризуйте световую и темновую фазы фотосинтеза.
Почему в результате фотосинтеза у зеленых растений в атмосферу выделяется свободный кислород?
Что такое хемосинтез?
Приведите примеры фотосинтезирующих организмов.
Какие организмы называются гетеротрофными? Приведите примеры.
Раздел 4. Размножение живых организмов
Способность к размножению, или самовоспроизводство, - одна из важнейших характеристик органической природы. Размножение – свойство, присущее всем без исключения живым организмам – от бактерий до млекопитающих. Существование любого вида животных и растений, бактерий и грибов, преемственность между родительскими особями и их потомством поддерживаются только благодаря размножению.
Необходимое условие размножения - наследственность, т.е. способность воспроизводить свойства и признаки родителей.
Известны различные формы размножения, но все они могут быть объединены в два типа: половое и бесполое.
Половым размножением называют смену поколений и развитие организмов на основе специализированных - половых клеток, образующихся в половых железах. В эволюции размножения наиболее прогрессивным оказался способ, благодаря которому новый организм развивается в результате слияния двух половых клеток, образованных разными родителями. Однако у беспозвоночных животных нередко сперматозоиды и яйцеклетки формируются в теле одного организма. Такое явление - обоеполость - называют гермафродитизмом. Цветковые растения также бывают обоеполыми. Известны случаи, когда новый организм, не обязательно появляется в результате слияния половых клеток. У некоторых видов животных и растений наблюдается развитие из неоплодотворенной яйцеклетки. Такое размножение называют девственным, или партеногенетическим.
Бесполое размножение характеризуется тем, что новая особь развивается из неполовых (соматических) клеток.
Вопросы для самопроверки:
Какие способы размножения вам известны? Что такое половое размножение?
У каких организмов встречается бесполое размножение? Какие формы бесполого размножения вам известны? Приведите примеры.
Почему при бесполом размножении потомки генетически сходны между собой и с родительской особью?
Чем половое размножение отличается от бесполого? Укажите отличия мейоза от митоза.
В чем заключается биологический смысл мейоза? Почему зрелые половые клетки одного организма несут разные комбинации генов?
В нем состоят эволюционные преимущества полового размножения перед бесполым?
