1. Инициация - первый этап транскрипции, в ходе которого происходит связывание РНК-полимеразы с промотором и образование первой межнуклеотидной связи.
У бактерий холофермент РНК-полимераза непосредственно узнает определенные последовательности нуклеотидных пар в составе промотора: последовательность 5-ТАТААТ-3 (расположена на расстоянии 10 нуклеотидов от точки начала транскрипции и называется боксом Прибнова) и последовательность 5-ТТГАЦА-3 (удалена от точки начала транскрипции на 35 нуклеотидов). В некоторых оперонах, например в лактозном, необходимо предварительное взаимодействие с промотором дополнительного белка (САР изменяет структуру промотора, резко повышая его сродство к РНК-полимеразе).
РНК-полимеразы эукариот не способны самостоятельно связываться с промоторами транскрибируемых генов. В присоединении к транскриптонам РНК-полимераз принимают участие общие факторы транскрипции (TF). Они отличаются от σ-факторов прокариот тем, что могут связываться с ДНК независимо от РНК-полимеразы. Полимеразы I, II и III требуют присутствия разных факторов транскрипции, обозначаемых TF I, TF II и TF III соответственно. Промоторы эукариот устроены более сложно, чем прокариотические, и состоят из нескольких элементов. Из низ самым близким к точке начала транскрипции является ТАТА-домен, называемый также доменом Хогнесса. Затем следуют домены ЦААТ и ГЦ. Промоторы эукариот могут содержать различные комбинации этих элементов, но ни один из них не встречается во всех промоторах. Домен ЦААТ играет существенную роль в инициации транскрипции, ТАТА и ГЦ, по-видимому, выполняют вспомогательные функции.
Связавшись с промотором, РНК-полимераза вызывает локальную денатурацию ДНК, т. е. разделение цепей ДНК на протяжении примерно 15 нуклеотидных пар. Образуется транскрипционный «глазок». Первым в строящуюся цепь РНК включается пуриновый нуклеотид - АТФ или ГТФ, при этом все три его фосфатных остатка сохраняются. После образования первой фосфодиэфирной связи σ-фактор у бактерий теряет связь с ферментом, и оставшийся core -фермент начинает перемещаться по ДНК. РНК-полимераза эукариот после инициации транскрипции также теряет связь с транскрипционными факторами и перемещается по ДНК самостоятельно.
2. Элонгация
- последовательное удлинение растущей цепи РНК. Перемещаясь вдоль двойной спирали ДНК, РНК-полимераза непрерывно раскручивает спираль впереди того участка, где происходит синтез РНК
. На короткое время образуется так называемый открытый комплекс, внутри которого возникает РНК-ДНК-спираль длиной около 20 нуклеотидов
(рис. 30). Затем фермент (с помощью специального сайта) вновь закручивает
Рис. 30. Элонгация транскрипции
ДНК позади участка полимеризации. РНК-транскрипт выводится из комплекса через особый канал, свойственный РНК-полимеразе.
Скорость синтеза РНК у бактерий составляет около 30 нуклеотидов в секунду, однако она не постоянна и может несколько снижаться. Такие периоды называют паузами транскрипции.
Показано, что еще до образования гибрида РНК-ДНК РНК-полимераза переводит ДНК из В-формы в А-форму. В ней плоскости азотистых оснований не перпендикулярны оси спирали, а наклонены на 20 0 к перпендикуляру. Вероятно, это облегчает разъединение двух соседних азотистых оснований в цепи ДНК. Параметры РНК-ДНК-спирали также практически полностью идентичны характеристикам А-формы ДНК.
3. Терминация (окончание транскрипции) определяется особой нуклеотидной последовательностью ДНК, расположенной в зоне терминатора оперона.
В бактериальных оперонах выделяют два типа терминаторов:
- ρ (ро) - независимые терминаторы (I типа);
- ρ - зависимые терминаторы (II типа).
Рис. 31. ρ- независимая терминация транскрипции у бактерий
ρ-независимые терминаторы состоят из последовательностей, представляющих собой инвертированный повтор - палиндром (рис. 31), и располагаются за 16-20 нуклеотидных пар от точки терминации. Палиндромы (последовательности, которые читаются одинаково слева направо и справа налево) ρ- независимых терминаторов содержат большое количество Г-Ц-повторов. За этим участком на матричной цепи расположена олиго (А) - последовательность (4-8 адениловых нуклеотидов подряд). Транскрипция в области палиндрома приводит к тому, что в получившемся РНК-транскрипте быстро образуется устойчивый элемент вторичной структуры - «шпилька» - спирализованная область, содержащая комплементарные
Г-Ц-пары. «Шпилька» нарушает прочность связи ДНК-РНК в открытом комплексе. Кроме этого транскрипция олиго(А)-последовательности в матричной цепи ведет к образованию участка ДНК-РНК-гибрида, составленного из непрочных А-У пар, что также способствует разрушению контакта между ДНК и РНК.
ρ-зависимые терминаторы. Одним из факторов транскрипции прокариот является белок ρ . ρ -фактор - это имеющий четвертичную структуру белок, обладающий АТФ-азной активностью. Он способен связываться с 5-концом синтезируемой РНК длиной около 50 нуклеотидов. ρ -фактор движется по РНК с такой же скоростью, с которой РНК-полимераза движется по ДНК. Вследствие того что в терминаторе много Г-Ц-пар (с тремя водородными связями), РНК-полимераза в области терминатора замедляет ход, ρ -фактор ее догоняет, изменяет конформацию фермента, и синтез РНК прекращается (рис. 32).
На терминаторах обоих типов происходят три ключевых события:
Останавливается синтез РНК;
Цепь РНК освобождается от ДНК;
РНК-полимераза освобождается от ДНК.
В биологии процессы транскрипции и трансляции рассматривают в рамках биосинтеза белка. Хотя в процессе транскрипции никакого синтеза белка не происходит. Но без нее невозможна трансляция (т. е. непосредственный синтез белка). Транскрипция предшествует трансляции.
Протекающие в клетках транскрипция и трансляция согласуются с так называемой догмой молекулярной биологии (выдвинутой Ф. Криком в середине XX века): поток информации в клетках идет в направлении от нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) к белкам, но никогда наоборот (то есть от белков к нуклеиновым кислотам). Это значит, что нуклеиновая кислота может служить информационной матрицей для синтеза белка, а белок не может выступать таковой для синтеза нуклеиновой кислоты.
Транскрипция
Транскрипция представляет собой синтез молекулы РНК на молекуле ДНК . То есть ДНК служит матрицей для синтеза РНК.
Транскрипция катализируется рядом ферментов, наиболее важный РНК-полимераза. Следует помнить, что ферменты - это в основном белки (это касается и РНК-полимеразы).
РНК-полимераза движется по двойной цепи ДНК, разъединяет цепочки и на одной из них по принципу комплементарности строит молекулу РНК из плавающих в ядре нуклеотидов. Таким образом, РНК по-сути идентична участку другой цепи ДНК (на которой не происходит синтез), так как цепи молекулы ДНК также комплементарны друг другу. Только в РНК тимин заменен на урацил.
Синтез нуклеиновых кислот происходит в направлении от 5"-конца молекул к их 3"-концу. При этом комплементарные цепи всегда антипараллельны (направлены в разные стороны). Поэтому сама РНК синтезируется в направлении 5"→3", но по цепи ДНК движется в ее направлении 3"→5".
Участок ДНК, на котором происходит транскрипция (транскриптон, оперон), состоит из трех частей: промотора, гена (в случае иРНК, вообще - транскрибируемой части) и терминатора.
Для инициации (начала) транскрипции нужны различные белковые факторы, которые прикрепляются к промотору, после чего к ДНК может быть присоединена РНК-полимераза.
Терминация (окончание) транскрипции происходит после того, как РНК-полимераза встретит один из стоп-кодонов.
У клеток эукариот транскрипция происходит в ядре. После синтеза молекулы РНК здесь же подвергаются созреванию (из них вырезаются ненужные участки, молекулы принимают соответствующую им вторичную и третичную структуру). Далее различные типы РНК выходят в цитоплазму, где участвуют в следующем после транскрипции процессе – трансляции.
Трансляция
Трансляция представляет собой синтез полипептидной (белковой) цепи на молекуле информационной (она же матричная) РНК. По-другому трансляцию можно описать как перевод информации, закодированной с помощью нуклеотидов (триплетов-кодонов), в информацию, представленную в виде последовательности аминокислот. Этот процесс протекает при участии рибосом (в состав которых входит рибосомальная РНК) и транспортной РНК. Таким образом, в непосредственном синтезе белка принимают участие все три основных типа РНК .
При трансляции рибосомы насаживаются на начало цепи иРНК и далее движутся по ней в направлении к ее концу. При этом происходит синтез белка.
Внутри рибосомы есть два «места», где могут поместиться две тРНК. Транспортные РНК, заходящие в рибосому, несут одну аминокислоту. Внутри рибосомы синтезируемая полипептидная цепь присоединяется к вновь прибывшей аминокислоте, связанной с тРНК. После чего эта тРНК передвигается на другое «место», из него же удаляется «старая», уже свободная от растущей полипепдидной цепи тРНК. На освободившееся место приходит еще одна тРНК с аминокислотой. И процесс повторяется.
Активный центр рибосомы катализирует образование пептидной связи между вновь прибывшей аминокислотой и ранее синтезированным участком белка.
В рибосому помещаются два кодона (всего 6 нуклеотидов) иРНК. Антикодоны тРНК, заходящих в рибосому, должны быть комплементарны кодонам, на которых «сидит» рибосома. Разным аминокислотам соответствуют разные тРНК (различающиеся своими антикодонами).
Таким образом, каждая тРНК несет свою аминокислоту. При этом следует иметь в виду, что аминокислот, принимающих участие в биосинтезе белка, всего около 20, а смысловых (обозначающих аминокислоту) кодонов около 60-ти. Следовательно, одну аминокислоту могут переносить разные тРНК, но их антикодоны соответствуют одной и той же аминокислоте.
Транскрипция
- процесс синтеза РНК с использованием ДНК в качестве матрицы, происходящий во всех живых клетках. Другими словами, это перенос генетической информации с ДНК на РНК.
В процессе транскрипции генов происходит биосинтез молекул РНК, комплементарных одной из цепей матричной ДНК, сопровождаемый полимеризацией четырех рибонуклеозидтрифосфатов (ATP, GTP, CTP и UTP) с образованием 3"–5"-фосфодиэфирных связей и освобождением неорганического пирофосфата.
Транскрипция катализируется ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой
. Процесс синтеза РНК протекает в направлении от 5"- к 3"- концу, то есть по матричной цепи ДНК РНК-полимераза движется в направлении 3"->5"
РНК-полимеразы могут состоять из одной или нескальких субъединиц. У митохондрий и некоторых бактериофагов, например SP6, T7 с небольшим числом генов простых геномов, где отсутствует сложная регуляция РНК-полимераза состоит из одной субъединицы. Для бактерий и эукариот, с большим числом генов и сложными системами регуляции РНК-полимеразы состоят из нескольких субъединиц. Показано, что фаговые РНК-полимеразы состоящие из одной субъединицы могут взаиодействовать с белками бактерий, которые меняют их свойства [Патрушев, 2000].
У прокариот синтез всех видов РНК осуществляется одним и тем же ферментом.
У эукариот - 3 ядерные РНК-полимеразы, митохондриальные РНК-полимеразы, хлоропластные РНК-полимеразы.
Субстратами для РНК-полимераз служат рибонуклеозид-трифосфаты (активированные нуклеотиды). Весь процесс транскрипции осуществляется за счет энергии макроэргических связей актвированных нуклеотидов.
Первый нуклеотид в РНК всегда пурин в форме трифосфата.
Факторы транскрипции
- белки взаимодействующие с друг другом, регуляторными участками ДНК и РНК-полимеразой с образованием транскрипционного комплекса и регулирующие транскрипцию. Благодаря факторам транскрипции и регуляторным последовательностям генов становится возможным специфический синтез РНК.
Принципы транскрипции
комплиментарность - mRNA комплиментарна матричной цепи ДНК и аналогична кодирующей цепи ДНК
антипараллельность
униполярность
беззатравочность - РНК-полимераза не требует праймера
асимметричность
Стадии транскрипции
- распознавание промотора и связывание - РНК-полимераза связывается с ТАТА-боксом 3’-промотора при помощи основных факторов транскрипции, дополнительные факторы ингибируют или стимулируют присоединение
- инициация - образование первой фосфодиэфирной связи между Pu и первым нуклеотидом. К пуринтрифосфату присоед нуклеотид комплиментарный второму нуклеотиду ДНК с отщеплением пирофосфата от нуклеозидтрифосфата с образ диэфирной связи
- элонгация (3’→5’)- мРНК гомологичная нематричной (кодирующей, смысловой) ДНК, синтезируется на матричной ДНК; какая из двух цепей ДНК будет матрицей, определяется направлением промотора
- терминация
Транскрипционные фабрики
Существует ряд экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что транскрипция осуществляется в так называемых транскрипционных фабриках: огромных, по некоторым оценкам, до 10 МДа комплексах, которые содержат около 8 РНК-полимераз II и компоненты последующего процессинга и сплайсинга, а также пруф-ридинга новосинтезированного транскрипта. В ядре клетки происходит постоянный обмен между пулами растворимой и задействованной РНК-полимеразы. Активная РНК-полимераза задействована в таком комплексе, который в свою очередь является структурной организовывающей компактизацию хроматина единицей. Последние данные. свидетельствуют о том, что транскрипционные фабрики существуют и в отсутствие транскрипции, они фиксированы в клетке (пока не ясно, взаимодействуют ли они с матриксом клетки или нет) и представляют собой независимый ядерный субкомпартмент. Попытки выделить белковый функциональный комплекс транскрипционной фабрики пока не привели к успеху ввиду его огромных размеров и низкой растворимости.
Прежде чем начнут синтезироваться белки, информацию об их строении необходимо "достать" из ДНК и доставить ее к месту синтеза белков. Этим занимаются информационные или матричные РНК . Одновременно клетке нужны транспортеры аминокислот – транспортные РНК и структурные компоненты органелл, синтезирующих белок, – рибосомальные РНК . Вся информация о строении транспортных и рибосомальных РНК также находится в ДНК.
Поэтому существует процесс переписывания или транскрипции данных с ДНК на РНК (англ. transcription – переписывание) – биосинтез РНК на матрице ДНК.
Как в любом матричном биосинтезе в транскрипции выделяют 5 необходимых элементов:
- матрица – одна из цепей ДНК,
- растущая цепь – РНК,
- субстрат для синтеза – рибонуклеотиды (УТФ, ГТФ, ЦТФ, АТФ),
- источник энергии – УТФ, ГТФ, ЦТФ, АТФ.
- ферменты РНК-полимеразы и белковые факторы транскрипции.
Биосинтез РНК происходит в участке ДНК, который называется транскриптон , с одного края он ограничен промотором (начало), с другого – терминатором (конец).
РНК-полимеразы эукариот имеют по две больших субъединицы и несколько малых субъединиц.
Стадии транскрипции
Выделяют три стадии транскрипции: инициация, элонгация и терминация.
Инициация
Промотор содержит стартовый сигнал транскрипции – ТАТА-бокс . Так называется определенная последовательность нуклеотидов ДНК, связывающая первый фактор инициации ТАТА-фактор . Этот ТАТА-фактор обеспечивает присоединение РНК-полимеразы к той нити ДНК, которая будет использоваться в качестве шаблона для транскрипции (матричная нить ДНК). Так как промотор ассиметричен ("ТАТА"), то он связывает РНК-полимеразу только в одной ориентации, что определяет направление транскрипции от 5"-конца к 3"-концу (5"→3"). Для связывания РНК-полимеразы с промотором необходим еще один фактор инициации – σ-фактор (греч. σ – "сигма"), но сразу после синтеза затравочного фрагмента РНК (длиной 8-10 рибонуклеотидов) σ-фактор отрывается от фермента.
Другие факторы инициации раскручивают спираль ДНК перед РНК-полимеразой.
Схема процесса транскрипции
Элонгация
Белковые факторы элонгации обеспечивают продвижение РНК-полимеразы вдоль ДНК и расплетают молекулу ДНК на протяжении примерно 17 нуклеотидных пар. РНК-полимераза продвигается со скоростью 40-50 нуклеотидов в секунду в направлении 5"→3". Фермент использует АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ одновременно в качестве субстрата и в качестве источника энергии.
После расшифровки генетического кода встал вопрос: каким образом осуществляется перенос информации с ДНК на белок? Биохимическими исследованиями было установлено, что основная масса ДНК в клетке локализована в ядре, тогда как синтез белка идет в цитоплазме. Это территориальное разобщение ДНК и синтеза белка обусловило поиски посредника. Поскольку синтез белка шел с участием рибосом, то на роль посредника была выдвинута РНК. Была создана схема, иллюстрирующая направление потока генетической информации в клетке:
ДНК → РНК → белок
Она получила название центральной догмы молекулярной биологии. Ф. Крик постулировал, что синтез макромолекул по этой схеме осуществляется по матричному принципу. На доказательство правильности этого постулата потребовались многие годы.
Вначале предполагалось, что роль посредника выполняет рибосомальная РНК (“один ген — одна рибосома — один белок”). Однако в скором времени выяснилась несостоятельность такого предположения. Было показано, что в процессе белкового синтеза количество рибосом не изменяется, т.е. новая РНК не синтезируется и, следовательно, новая информация не поступает. Вскоре в составе рибосом была обнаружена фракция нестабильной РНК, молекулы которой непрочно удерживаются на рибосоме с помощью катионов Mg. Методом молекулярной гибридизации было показано, что молекулы этой РНК являются копиями определенных участков ДНК. Она получила название матричной , или информационной РНК . Ее также называли раньше РНК-посредник и мессенджер-РНК. Комплементарность этих молекул определенным участкам ДНК говорила о том, что они синтезируются по матричному типу на ДНК.
Постепенно был выяснен весь путь переноса информации от ДНК к белку. Он состоит из двух этапов: транскрипции и трансляции . На этапе транскрипции происходит считывание и перенос генетической информации с ДНК на иРНК. Процесс транскрипции протекает в три стадии: инициации , элонгации и терминации . Информация считывается только с одной цепи ДНК (+ цепь), так как исходя из свойств генетического кода, комплементарные участки ДНК не могут кодировать структуру одного и того же белка из-за отсутствия комплементарной вырожденности кода. Ведет транскрипцию фермент РНК-полимераза, состоящий из четырех субъединиц (ααββ") и не обладающий специфичностью в отношении источника ДНК. На начальном этапе транскрипции — инициации — к ферменту присоединяется пятая субъединица, так называемый s-фактор, который осуществляет узнавание специфического участка ДНК, промотора. Промоторы не транскрибируются. Узнаются они s-фактором по наличию в них специфической последовательности нуклеотидов. В бактериальных промоторах она называется блоком Прибнова и имеет вид ТАТААТ (с небольшими вариациями). К промотору присоединяется фермент РНК-полимераза. Рост цепи иРНК идет в одном направлении, скорость транскрипции равняется ≈ 45-50 нуклеотидов в 1 секунду. На этапе инициации синтезируется только короткая цепочка из 8 нуклеотидов, после чего s-фактор отделяется от РНК-полимеразы и начинается этап элонгации. Наращивание цепи иРНК ведет уже белок-тетрамер. Участок, с которого считывается информация, называется транскриптоном. Он заканчивается терминатором — специфической нуклеотидной последовательностью, играющей роль stop-сигнала. Дойдя до терминатора, фермент РНК-полимераза прекращает работу и с помощью белковых факторов терминации отделяется от матрицы.
В бактериальных клетках образующиеся молекулы иРНК могут сразу выполнять роль матриц для синтеза белка, т.е. транслироваться. Они соединяются с рибосомами, к которым одновременно молекулы транспортных РНК (тРНК) доставляют аминокислоты. Цепочки транспортных РНК состоят примерно из 70 нуклеотидов. Однонитиевая молекула тРНК имеет участки комплементарного спаривания, в составе которых находятся активные центры: участок узнавания тРНК ферментом тРНК-синтетазой, присоединяющим к тРНК соответствующую активированную аминокислоту; акцептор — участок, к которому присоединяется аминокислота, и антикодоновая петля.
Антикодон — это триплет, комплементарный соответствующему кодону в молекуле иРНК. Взаимодействие кодон-антикодон идет по типу комплементарного спаривания, во время которого происходит присоединение аминокислоты к растущей белковой цепи. Инициирующим кодоном в составе разных иРНК является кодон AUG, соответствующий аминокислоте метионину. Поэтому первой к матрице подходит тРНК с антикодоном UAC, соединенная с активированной аминокислотой метионином. Ферменты, активирующие аминокислоты и соединяющие их с тРНК, называются аминоацил-тРНК-синтетазы. Все этапы биосинтеза белка (инициация, элонгация, терминация) обслуживаются белковыми факторами трансляции. У прокариот их по три на каждый этап. В конце матрицы иРНК находятся нонсенс-кодоны, которые не считываются и знаменуют собой конец трансляции.
В геноме многих организмов, от бактерий до человека, обнаружены гены и соответствующие им тРНК, осуществляющие нестандартное считывание кодонов. Это явление получило название неоднозначности трансляции .
Оно позволяет избежать негативных последствий ошибок, возникающих в структуре молекул иРНК при транскрипции. Так, при появлении внутри молекулы иРНК нонсенс-кодонов, способных преждевременно прекратить процесс транскрипции, включается механизм супрессии. Он состоит в том, что в клетке появляется необычная форма тРНК с антикодоном, комплементарным нонсенс-кодону, чего в норме быть не должно. Ее появление является результатом действия гена, осуществляющего замену основания в антикодоне тРНК, близким по составу к нонсенс-кодону. В результате такой замены нонсенс-кодон считывается как обычный значащий кодон. Подобные мутации получили название супрессорных, т.к. они подавляют изначальную мутацию, которая привела к появлению нонсенс-кодона.
